Zusammenfassung
Das 20S Proteasom übernimmt eine zentrale Rolle sowohl beim Proteinabbau als auch bei der Generierung von Antigenen für die zelluläre Immunantwort. Die proteolytische Aktivität des 20S Proteasoms wird durch die katalytischen -Untereinheiten MB1, delta und Z im Fall der Konstitutiv-Proteasomen und durch LMP7, LMP2 und MECL-1 bei den Immuno-Proteasomen vermittelt. Die Untersuchungen von Dahlmann et al. (2000) zeigten, dass neben den bis dahin bekannten zwei Formen des 20S Proteasoms (Immuno- und Konstitutiv-Proteasom) eine weitere Form existiert, die Intermediär-Proteasomen. Diese 20S Proteasomen besitzen als aktive -Untereinheit sowohl konstitutive als auch Immuno-Untereinheiten. Funktionelle und strukturelle Charakterisierungen von 20S Proteasomen aus verschiedenen Rattenorganen zeigten, dass die einzelnen Rattenorgane jeweils mehrere 20S Proteasom-Subtypen besitzen, wobei die Anzahl an Subtypen unterschiedlich war. Anhand der vorhandenen katalytischen -Untereinheiten gelang die Zuordnung der 20S Proteasom-Subtypen in eine der drei Proteasom-Formen. Jedes Rattenorgan zeichnet sich durch ein spezifisches 20S Proteasom-Subtypen-Spektrum aus.

Blut wird häufig als „flüssiges Organ" bezeichnet. Die verschiedenen Komponenten des Blutes (Blutzellen und Plasma) übernehmen dabei verschiedene Funktionen, ähnlich wie ein Organ im Körper. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass humane Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten und T-Lymphozyten jeweils mehrere 20S Proteasom-Subtypen aufweisen, wobei die Anzahl der 20S Proteasom-Subtypen in den Blutzellen unterschiedlich ist. Mit Hilfe verschiedener biochemischer Analysen konnten die 20S Proteasom-Subtypen jeweils in eine der drei Proteasom-Formen eingruppiert werden. Daraus ergibt sich für jede Zelle ein charakteristisches 20S Proteasom-Subtypen-Spektrum. Während bei den Thrombozyten, Monozyten und T-Lymphozyten die dominante Subpopulation die Intermediär-Proteasomen darstellen, bilden die Erythrozyten mit nur drei konstitutiven 20S Poteasom-Subtypen eine Besonderheit.

In einem weiteren Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Proteasom-Subtypen analysiert. Es wurde nachgewiesen, dass das Verhältnis der eingebauten katalytisch aktiven -Untereinheiten bei Proteasom-Subtypen einer Subpopulation unterschiedlich ist. Diese Unterschiede sind mitbestimmend für die unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften der Proteasom-Subtypen. Weiterhin entscheidend für die funktionellen Eigenschaften der Proteasom-Subtypen sind die verschiedenen Varianten der Untereinheiten. Untersucht wurde der prozentuale Einbau der einzelnen Varianten verschiedener - und -Untereinheiten. Dabei zeigte sich, dass sich die 20S Proteasom-Subtypen einer Subpopulation in dem Verhältnis vorhandener Varianten voneinander unterscheiden. In der Gesamtheit bewirken die Unterschiede in der Zusammensetzung verschiedene Oberflächenladungen. Aufgrund dieser Unterschiede können die unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften der Subtypen erklärt werden.

Ein weiteres wichtiges Resultat der vorliegenden Arbeit ist die Isolierung und Charakterisierung von zirkulierenden 20S (c20S) Poteasomen aus Human-Plasma. Dabei gelang erstmalig der Nachweis, dass es sich bei den c20S Proteasomen um strukturell und funktionell komplette 20S Proteasom-Komplexe handelt. Von drei gesunden Spendern wurden die c20S Proteasom-Subtypen-Spektren ermittelt, wobei alle drei reproduzierbar das gleiche Spektrum aufwiesen. Obwohl der Ursprung nicht geklärt werden konnte, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die c20S Proteasomen einen gemeinsamen Ursprung haben und eine regulierte Abgabe der c20S Proteasomen ins Plasma vorliegen muß. Die Möglichkeit, dass die c20S Proteasomen aufgrund von Zelltod ins Plasma gelangen, wird durch diese Ergebnisse widerlegt.

In Patienten mit Autoimmun- bzw. onkologischen Erkrankungen erhöht sich deutlich die Konzentration an c20S Proteasomen im Plasma. Bislang wurde vermutet, dass die c20S Proteasomen aus Zellen stammen, die durch die Krankheit zerstört werden. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit c20S Proteasomen aus verschiedenen Patienten-Plasmen isoliert und ihre Proteasom-Subtypen-Spektren analysiert. Dabei gelang erstmalig die Trennung der c20S Proteasomen in einzelne Subtypen. Obwohl die drei Patienten verschiedene Autoimmunerkrankungen aufwiesen, bei denen unterschiedliche Zellen durch die Krankheit betroffen waren, sind die erzielten c20S Proteasom-Subtypen-Spektren nahezu identisch. Obwohl auch hier der Ursprung nicht geklärt werden konnte, kann man anhand der identischen Proteasom-Spektren schlussfolgern, dass die c20S Proteasomen vom gleichen Ursprung stammen müssen.

Vergleiche zwischen den c20S Proteasom-Spektren von gesunden und erkrankten Spendern zeigen, dass sich die Suptypen-Spektren nur geringfügig unterscheiden. Ob diese minimalen Unterschiede auf zusätzliche Proteasomen untergegangener Zellen zurückzuführen sind, bleibt ungeklärt.

1. Einleitung

1.1. Das Ubiquitin-Proteasom-System

Der regulierte Abbau von Proteinen stellt eine lebenswichtige Grundfunktion der Zelle dar, die von dem lysosomalen und den nicht-lysosomalen Abbausystemen übernommen wird. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist wesentlicher Bestandteil der nicht-lysosomalen Proteindegradation und besteht aus hochgradig organisierten Kaskaden von enzymatischen Reaktionen, die für die Selektion, die Markierung und den Abbau der Proteine verantwortlich sind (Coux et al., 1996). Das Erkennungssignal für den selektiven Proteinabbau ist dabei das Ubiquitin. Sein Name weist auf sein generelles, ubiquitäres Vorkommen in allen eukaryotischen Zellen hin. Zudem ist es im Reich der Eukaryonten hochkonserviert: das Ubiquitin aus Hefe- und menschlichen Zellen unterscheidet sich nur in drei Aminosäuren (Yang und Yu, 2003). Die Konjugation eines Ubiquitinmoleküls an das Substrat erfolgt mit Hilfe eines Ubiquitin-aktivierenden Enzyms (E1), eines konjugierenden (E2) Enzyms und einer Ligase (E3). Dabei wird ein Ubiquitinmolekül kovalent an die -Aminogruppe eines Lysinrests innerhalb des Substratproteins gebunden (Abb.1) (Hershko und Ciechanover, 1998)...